摘要: 实验动物在生命科学领域起着重要的基础性支撑作用,其巨大贡献往往与以承受痛苦和死亡为代价。斑马鱼作为重要的模式生物,近年来成为应用最广泛的实验动物之一。如何在保护实验结果科学可靠的前提下保障斑马鱼福利,是本领域科研人员面对的重要问题。文章系统讨论了斑马鱼研究中实验动物福利的关键点,涵盖痛苦感知、水环境、饲育、实验操作、运输及安乐死等方面,为提升实验室斑马鱼生存质量,推动实验鱼标准化进程提供理论支撑与实践参考。

摘要: 为研究黑鲷自体受精子代的遗传信息变化,采用全基因组重测序分析了3个黑鲷自体受精子代家系群体（BP246、BP291及BP384）的单核苷酸多态性（SNP）及遗传纯合等情况。3个群体共鉴定出3991267个SNP多态位点,其中位于内含子区位点占比最大（47.42%）;子代平均纯合位点占比（69.11%）显著高于亲本（38.49%）;BP246、BP291及BP384的观测杂合度（H_o）依次分别为0.2986、0.2875及0.2805,均低于各自的期望杂合度（H_e）0.3947、0.3946及0.3946;分析遗传分化指数(F_st)、主成分聚类及系统发育树结果得出子代群体间存在较高遗传分化;群体中共检测出10991个连续纯合片段（ROH）,其中<1 Mb短片段占52.5%,>2.5 Mb长片段占9.4%;于5个染色体中检测、鉴定出13个ROH岛,注释出到468个基因,其中显著富集到64个可能与生长、免疫等关键性状相关的候选基因,主要分布于钙信号（CACNA1S）、能量代谢（AMPD、ADCY5/6）、DNA修复（RAD18）及免疫调节（PIK3CA＿B＿D）等通路。研究结果为黑鲷育种策略的精细化构建及自交遗传学研究等提供科学依据。

摘要: 为阐明饲料硒水平对黄鳝(Monopterus albus)生长及抗氧化性能的影响和生产富硒黄鳝,设计了6组实验,每组4个重复,每个重复放养35尾黄鳝[均重(7.71±0.01) g]。以酵母硒(硒含量2000 mg/kg)为硒源在基础饲料(对照组,硒水平0.92 mg/kg)中添加硒,配制硒实测值为1.39、1.85、2.91、4.59、9.08 mg/kg五组实验饲料,进行了8周的养殖实验。结果:(1)不同硒水平饲料对黄鳝存活率、增重率、特定生长率及饲料系数均无显著影响(P>0.05);(2) 1.85—9.08 mg/kg组血清谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-Px)活力、1.85 mg/kg组血清总超氧化物歧化酶(T-SOD)及过氧化氢酶(CAT)活力及4.59 mg/kg组总抗氧化能力(T-AOC)均显著高于对照组(P<0.05),2.91—4.59 mg/kg组肝脏GSH-px活力、1.85 mg/kg组T-SOD、T-AOC及CAT活力均显著高于对照组(P<0.05);(3)以血清及肝脏GSH-px活力为评价指标,黄鳝饲料适宜硒含量为2.68—2.93 mg/kg;(4) 1.39—2.91 mg/kg组全鱼粗脂肪含量显著低于对照组(P<0.05);(5) 1.39—9.08 mg/kg组肌肉、肝脏及肠道硒含量、1.85—9.08 mg/kg组肾脏及皮肤硒含量以及2.91—9.08 mg/kg组脾脏硒含量均显著高于对照组(P<0.05),各组织硒蓄积量:肝脏>皮肤>肾脏>脾脏>肌肉>肠道。结果表明:黄鳝对饲料酵母硒具有较好的耐受力,饲料硒含量低于9.08 mg/kg对黄鳝生长性能无显著影响;适量提升饲料硒含量可改善黄鳝抗氧化能力, 7.71 g幼鳝适宜饲料硒含量为2.68—2.93 mg/kg。此外,提高饲料硒含量可促进黄鳝肌肉硒沉积,有利于生产富硒黄鳝,但需避免过量硒对黄鳝抗氧化功能的抑制效应。

摘要: 通过稀有鮈鲫(Gobiocypris rarus)卵膜蛋白质组测序鉴定黏性卵膜中富集的透明带蛋白(Zona pellucida glycoproteins, Zps),建立可用于卵型研究的稀有鮈鲫zp基因突变体和转基因斑马鱼(Danio rerio)。实验收集稀有鮈鲫胚胎(1hour post fertilization, hpf),分离收集足量卵膜,提取卵膜中的蛋白质进行测序分析。将测序数据进行拼接并与鲤科鱼类蛋白质进行比对,选取匹配度和丰度最高的基因zp2l2和zp4l进行实验。分别在zp2l2和zp4l的第一个外显子、第六个外显子设计CRISPR/Cas9敲除靶点,构建zp基因突变体。扩增斑马鱼zp3.2基因上游启动子序列(2874 base pairs, bps)和zp2l2、zp4l编码序列(1137、3009 bp),通过无缝克隆(Infusion cloning)将zp3.2启动子连接进入具有Tol2转座元件的质粒中,构得质粒pT2AL-zp3.2-eGPF;再将zp2l2、zp4l编码序列克隆到pT2AL-zp3.2-eGPF质粒中,得到可用于胚胎注射的转基因质粒pT2AL-zp3.2-zp2l2-eGPF和pT2AL-zp3.2-zp4l-eGPF。体外转录合成转座酶mRNA与构建的转基因质粒混合进行斑马鱼胚胎显微注射。通过稀有鮈鲫胚胎显微注射及三代鉴定,成功在稀有鮈鲫中敲除zp2l2和zp4l获得稳定遗传的纯合突变体;稀有鮈鲫zp转基因斑马鱼经传代鉴定,筛选得到了可稳定遗传的转基因品系Tg(zp3.2:zp2l2-eGPF)和Tg(zp3.2:zp4l-eGPF),这2个转基因品系的绿色荧光蛋白在斑马鱼胚胎发育的15d(days post fertilization, dpf)开始在卵巢和肝脏中表达。实验构建zp2l2和zp4l稀有鮈鲫突变体和转基因斑马鱼的方法,为鲤科鱼类卵型形成机制的研究提供了可行的实验思路和技术路线。

摘要: 为探讨水螅异种免疫排斥的分子机理,本研究探索并建立了一个以长锥形牙刷毛为载体、把两段水螅身体片段串联(嫁接)起来的方法,并以中国绿水螅(Hydra sinensis)野生型品系(体内有共生藻,身体呈现绿色)、中国绿水螅无藻品系及寻常水螅(Hydra vulgaris)为移植材料,通过显微操作分别成功制备了水螅同种移植(绿水螅野生型品系切除尾部后的伤口与绿水螅无藻品系切除头部后的伤口之间的嫁接)嵌合体及异种移植(绿水螅野生型品系切除尾部后的伤口与寻常水螅切除头部后的伤口之间的嫁接)嵌合体。在移植手术结束12h时60%以上的异种移植嵌合体结构完整(两段水螅身体仍为连接状态)、24h时约40%的异种移植嵌合体结构完整、36h时不到20%的异种移植嵌合体结构完整、48h后已观察不到结构完整的异种移植嵌合体,这反映了在水螅异种移植嵌合体中存在显著的免疫排斥现象;相反,移植手术结束96h时约85%的同种移植嵌合体中两段水螅身体连接处的组织完全融合,并且这些同种移植嵌合体能够长期存活,这说明在同种移植嵌合体中免疫排斥现象即使存在也非常轻微。在此基础上,以移植手术结束24h时的同种移植嵌合体为对照,对移植手术结束24h时的异种移植嵌合体进行了转录组分析。异种移植嵌合体与同种移植嵌合体间共筛选出24125个差异表达基因(Differentially expressed genes, DEGs),其中17707个表达上调, 6418个表达下调;基于DEGs富集分析获得了26条显著KEGG通路(P<0.05),其中3条通路涉及先天免疫系统、2条通路涉及铁死亡、2条通路涉及凋亡,还有15条物质代谢通路与免疫细胞代谢重编程相关;根据KEGG富集结果统计到的与先天免疫系统直接相关的33个代表性DEGs中大部分(30个基因)表达上调,其中12个基因参与免疫应答, 4个基因涉及凋亡, 6个基因与蛋白质泛素化相关, 4个基因涉及蛋白质折叠, 4个基因涉及细胞信号转导,还有3个基因参与物质转运。结果表明,水螅异种移植手术激活了水螅的先天免疫反应、铁死亡和凋亡进程,而铁死亡和凋亡可对水螅的先天免疫水平进行调控;被激活的先天免疫系统引发了水螅免疫细胞代谢重编程,还通过抗原的加工和呈递通路启动水螅获得性免疫系统的活化进程,但没有发现水螅获得性免疫系统直接介入异种免疫排斥的相关证据。因此,水螅异种免疫排斥主要是先天免疫活动及免疫细胞代谢重编程两个因素共同作用的结果。研究为探讨动物异种免疫排斥的细胞及分子机理提供了基础数据。

摘要: 为探究罗氏沼虾(Macrobrachium rosenbergii)开口饲料中小肽的最适添加水平,在罗氏沼虾蚤状幼体饲料中添加0(SP0)、2.5%(SP2.5)、5%(SP5)、7.5%(SP7.5)和10%(SP10)的小肽蛋白,制成小肽水平分别为0、0.98%、1.97%、2.95%和3.94%的5组等氮等脂饲料。实验选取同一批次罗氏沼虾亲体产下的蚤状幼体125000尾[初重:(0.17±0.01) mg],随机分至5个实验组,每组5个平行桶(200 L),每个桶5000尾幼体。实验养殖31d。结果表明, SP2.5组幼体存活率和出苗率显著高于SP0组(P<0.05),基于幼体出苗率做折线回归分析得出,罗氏沼虾幼体饲料中小肽的最适添加水平为0.907%。SP2.5组幼体末重、增重率、特定生长率和抗应激死亡率均显著低于SP10组(P<0.05),基于抗应激死亡率折线回归分析得出,罗氏沼虾幼体饲料中小肽的最适添加水平为1.14%。SP2.5组丙二醛含量最低,且显著低于SP7.5组(P<0.05)。SP2.5和SP5组幼体抗应激死亡率显著低于其他组(P<0.05);而SP5组幼体超氧化物歧化酶活性显著高于SP0组(P<0.05); SP5组幼体变态率显著低于SP0组(P<0.05)。添加小肽对罗氏沼虾幼体碱性磷酸酶和酸性磷酸酶活性均有提高,且添加小肽的4个组酸性磷酸酶活性均显著高于SP0组(P<0.05)。综上所述,饲料中添加小肽可提高罗氏沼虾幼体的出苗率和抗应激能力,建议罗氏沼虾幼体饲料中小肽的添加水平为0.907%—1.14%。

摘要: 研究以斑马鱼(Danio rerio)为模型,旨在探究饲料中添加益生菌鼠李糖乳杆菌(Lactobacillus rhamnosus)对三丁基锡(TBT)毒性的改善作用及其机制。研究选用成年斑马鱼,分为3组:DMSO(二甲基亚砜)(对照组),TBT(2μg/L TBT)和TBT+PRO(2μg/L TBT补充鼠李糖乳杆菌),进行为期21d的饲喂。结果显示,与TBT单独暴露相比,同时补充L. rhamnosus后,斑马鱼肠道内厚壁菌门(Firmicutes)和乳杆菌属(Lacticaseibacillus)的丰度显著升高;肠道内壁厚度增加、肠绒毛损伤得到缓解,脑室肿大及心脏组织炎症细胞浸润和空泡化减轻。在分子水平上,肠道、脑和心脏中促炎因子(tnf-α、il-1β)的表达显著下调,抑炎因子(il-10)的表达显著上调;肠道紧密连接蛋白基因(claudin-2、zo-1)表达升高,肠道通透性降低。此外,斑马鱼脑、血清和肠道中的脂多糖(LPS)水平显著降低,下丘脑-垂体-肾间(HPI)轴相关基因(crhr2、mr、pomc)的过度表达受到抑制,关键神经元基因(α1-tubulin、bdnf、shha)的表达有所恢复,皮质醇(Cor)水平显著下降,且心脏中凋亡相关基因(caspase-3、caspase-9、bax)的表达显著下调。以上结果表明, L. rhamnosus能调节斑马鱼肠道菌群平衡、降低LPS水平、抑制HPI轴过度激活及缓解炎症与凋亡反应,改善TBT暴露引起的神经和心血管系统损伤,为水产养殖中TBT污染的生物修复及益生菌应用提供了理论依据和实践策略。

摘要: 为探究黄姑鱼(Nibea albiflora)幼鱼肠道菌群变化、关键细菌类群及其与养殖水体细菌群落的相关性,实验以黄姑鱼幼鱼为研究对象,分别于36、46、66、86和106日龄采集黄姑鱼肠道内容物样品和同时期的养殖水体菌群样品,利用16S rRNA高通量测序手段,基于生物信息学方法,系统解析黄姑鱼幼鱼肠道菌群的组成、结构、时序变化、核心物种及其与生长和养殖水体菌群的相关性。研究结果表明,不同日龄黄姑鱼肠道菌群中Chao1指数均显著低于同时期养殖水体,而Shannon指数均显著高于同时期养殖水体;不同日龄黄姑鱼肠道菌群中Chao1指数呈现先显著升高后逐渐稳定的趋势,而Shannon指数则呈现相反的趋势;随着黄姑鱼幼鱼的生长,养殖水体细菌群落中Chao1指数呈现先下降后上升的显著趋势(P<0.05);而Shannon指数呈现先上升后显著下降的趋势(P<0.05)。PERMANOVA和ANOSIM分析揭示,随着黄姑鱼幼鱼的生长,其肠道菌群结构显著改变(P<0.05),同时,幼鱼肠道菌群与同时期的养殖水体细菌群落结构差异显著(P<0.05)。黄姑鱼幼鱼肠道菌群中优势菌门为拟杆菌门(Bacteroidetes)、厚壁菌门(Firmicutes)和变形菌门(Proteobacteria),其中,拟杆菌门的相对丰度在46日龄后显著升高(P<0.05);相反,厚壁菌门和变形菌门的相对丰度在46日龄后显著降低(P<0.05)。在养殖水体中,优势菌门为拟杆菌门、髌骨菌门(Patescibacteria)和变形菌门;其中,拟杆菌门和髌骨菌门的相对丰度呈现显著升高的趋势,而变形菌门的相对丰度显著下降。在科水平上,黄姑鱼幼鱼肠道菌群中优势菌科为毛螺菌科(Lachnospiraceae)、Muribaculaceae、普雷沃氏菌科(Prevotellaceae)和链球菌科(Streptococcaceae),其中毛螺菌科、普雷沃氏菌科和链球菌科的相对丰度在46日龄后显著降低(P<0.05),而Muribaculaceae的相对丰度显著升高(P<0.05)。在养殖水体中,优势菌科为Clade＿I、黄杆菌科(Flavobacteriaceae)和红杆菌科(Rhodobacteraceae),其中, Clade＿I相对丰度呈现显著下降趋势(P<0.05),而黄杆菌科和红杆菌科的相对丰度呈现先上升后下降的趋势(P<0.05)。普鲁克分析和溯源分析揭示,黄姑鱼幼鱼肠道菌群与其养殖水体细菌群落相关性不显著(P<0.05)。生境特异性分析、随机森林分析和Mantel检验等方法相结合,揭示了与黄姑鱼生长相关的关键细菌类群。此外,通过黄姑鱼幼鱼肠道菌群的体外分离培养获得2株与其生长相关的潜在原籍益生菌菌株。综上,本研究揭示了黄姑鱼幼鱼肠道菌群的时序变化、关键细菌类群及其与养殖水体细菌群落的相关性,为黄姑鱼幼鱼原籍益生菌的研发提供参考依据。

摘要: 为了提高草鱼苗种的质量与其在高密度养殖环境下的生产性能,本研究建立了基于Percoll密度梯度离心的草鱼精子分选技术,使用40%/87.5%Percoll密度梯度离心体系可以将草鱼精子分为上层和底层两部分。与对照组（未离心）的精子相比,底层精子的CMA3染色荧光强度显著降低,表明其染色质压缩程度更高;此外,底层精子还表现出更高的运动精子百分比、平均运动速度和曲线运动速度,用于人工繁殖具有更高的受精率。在相同养殖环境下,底层精子繁育的子代在90日龄时体重和存活率均显著高于上层精子和对照精子繁育的子代。在150日龄,我们进一步探索了养殖密度对草鱼生长性能的影响。在低密度养殖环境下（5 kg/m₃）养殖60d后,底层精子繁育草鱼的增重率和饲料转化效率分别比对照精子繁育草鱼的高25.38%和4.84%,而在高密度养殖环境（20 kg/m₃）下养殖60d后,底层精子繁育草鱼的增重率和饲料转化效率分别比对照精子繁育草鱼的高69.36%和8.62%。在低密度养殖环境下,各组精子繁育的草鱼血清皮质醇浓度无显著性差异,而高密度养殖环境下,对照组精子繁育的草鱼血清皮质醇浓度显著高于底层精子繁育的草鱼。分别对不同养殖密度下底层精子、上层精子及对照精子繁育的草鱼肝脏和肌肉组织进行了转录组测序,结果显示底层精子后代在高密度养殖胁迫下表现出最少的差异表达基因数量, KEGG富集结果显示高密度养殖胁迫显著影响了底层和对照精子后代肌肉和肝脏组织的能量代谢、免疫应答和细胞应激通路。此外,使用qRT-PCR对6个生长和免疫相关的差异表达基因的转录组测序结果进行了验证, qRT-PCR和FPKM的log₁₀fold change之间的皮尔逊相关系数为0.871,具有显著相关性（P<0.001）,表明转录组分析结果可靠。上述结果表明, Percoll密度梯度离心法能有效分离草鱼高质量精子,提高苗种质量和高密度养殖的适应性。

摘要: 对比研究荷-鱼共养与常规池塘养殖模式下浮游植物群落的变化规律及其与环境因子的关系。实验选取双峰县荷-鱼共养池塘和常规养殖池塘开展对比研究,通过春、夏、秋季的水质及浮游植物的监测,分析浮游植物群落结构变化与水质因子的相关性。(1)荷-鱼共养组的N、TP、TN、pH显著低于常规养殖组(P<0.05)。(2)荷-鱼共养组发现浮游植物93种(8门59属),常规养殖组发现浮游植物71种(7门50属),物种多样性较低。(3)两组池塘浮游植物群落结构差异显著,荷-鱼共养组绿藻门密度最高,裸藻门生物量最高,常规养殖组春夏季绿藻门密度最高,秋季蓝藻门密度最高,生物量以绿藻门和硅藻门占优势;经SIMPER分析,造成春、夏、秋季组间差异的关键藻种分别是舟形藻、栅藻、平裂藻,且均在常规养殖组中富集。(4) RDA分析表明,常规养殖组藻密度主要受N、TP、pH驱动,生物量与N呈显著正相关(P<0.05);荷-鱼共养组藻密度与N呈显著负相关,生物量主要受水温调控(P<0.05)。研究表明,相较于常规养殖,荷-鱼共养模式能有效降低养殖水体富营养化的风险,促进浮游植物的物种多样性,抑制蓝藻优势。研究可为荷-鱼生态养殖的科学管理提供参考。